すべての細胞は、膜で囲まれた小胞を放出します。これらは総称して細胞外小胞 (EV) と呼ばれています。これらの EV には、起源細胞から選択された一連の脂質、核酸、タンパク質が含まれており、複雑な情報を周囲または遠くの細胞に伝達できます。EV は、原核細胞および真核細胞の細胞膜 (PM) から直接出芽して形成されます。真核細胞では、EV は、エンドサイトーシス経路 (MVB) の内部多小胞コンパートメント内で最初に腔内小胞として形成され、その後、これらのコンパートメントが PM と融合して分泌されます。命名法を明確にするために、最近、「エクソソーム」という用語は、すべての小さな EV ではなく、MVB 由来の EV にのみ使用されることが提案されています。一方、PM 由来の EV は、マイクロベシクル、マイクロパーティクル、エクソソームなど、さまざまな名前で呼ばれています。外体。 エクソソームとエクトソームは異なる細胞内部位で形成されるため、特定の貨物の異なるセットを含み、したがって異なる機能を持つ可能性があります。ただし、生体液または細胞調整培地に存在する同じサイズのエクソソームからエクソソームを分離することが困難であること、エクソソームを細胞外小体と区別するための特定のタンパク質マーカーがないこと、および分子メカニズムとどちらか一方を識別する能力がまったくないことから、完全に特定のツールです。
1. CD63とCD9は2つの異なるEV集団と1つの共通EV集団に存在する
HeLa 細胞を使用して EV の分布を研究および分析したところ、免疫蛍光の結果から、CD63 は主に細胞内区画に存在することが示されました。対照的に、CD9 は主に細胞膜に存在しますが、まれに薄暗い細胞内区画にも存在します。定常状態では、2 つのタンパク質の顕著な共局在は観察されませんでした。
2. CD63 と CD9 は後期エンドソームを一時的に通過し、PM pHluorin は酸性条件下では実質的に非蛍光ですが、中性 pH では蛍光を発するため、酸性後期細胞内 MVB と細胞膜分子の融合を観察するための理想的なレポーターとなります。細胞の外部環境は中性 pH であるため、融合中に酸性から中性への遷移が起こります。免疫電子顕微鏡検査により、すべての時点で、ほとんどの MVB とリソソームには CD63 のみが含まれており、CD9 は含まれていないことが示されました。
3. CD63とは異なり、CD9とCD63-YAは、PMの局在と内部化の動態が類似しています。リソソーム標的化モチーフは、RUSHプラスミドトランスフェクションのためにCD63-YA、CD63-WT-eGFP、またはCD63-YA-eGFPに変異しています。HeLa細胞;結果は、定常状態では、CD63-WTとは対照的に、CD63-YAは主に細胞周辺といくつかの小さな細胞内区画に位置していることを示しました。動態モニタリングの結果は、変異CD63-YAが酸性の内部区画に入らないことを示しました。同時に、ビオチン処理後、結果はCD9とCD63-YAが同様の表面(AF647)/合計(GFP)蛍光強度比が1であり、定常状態ではさらに約2に増加することを示しました。 対照的に、CD63 の場合、最大表面/総比は増加しましたが、ビオチン添加後 2 時間までは 1 未満のままで、2 時間および定常状態では安定していました。状態間の減少では、CD63-YA と CD9 は同様に動作し、細胞膜上に蓄積します。
4. PMタンパク質はCD9-EVに豊富に含まれていますが、エンドソーム/リソソームタンパク質とPM膜貫通タンパク質はCD63-EVに豊富に含まれています。CD63+およびCD9+ EVの起源をより正確に特定し、PMまたはエンドソームを同定するために、生体から放出されたEVの特定のマーカーの定量的質量分析を実施しました。同期分泌CD63またはCD9 EVの定量的質量分析により、細胞膜およびエンドソーム由来EVの特性が明らかになり、PMタンパク質はCD9-EVに豊富に含まれています。一方、エンドソーム/リソソームタンパク質とPM膜貫通タンパク質はCD63-EVに豊富に含まれています。
研究の結論: この研究は、異なるテトラスパニンを含む EV の実際のエクソソームまたはエクソソーム特性を決定することを目的としました。これらの細胞から放出された EV の細胞内起源を決定するために、テトラスパニンの細胞内輸送を、小胞体 (ER) での最初の合成から EV での分泌まで、時間的に制御された方法で追跡しました。結果は、CD63 と CD9 の両方が細胞膜で形成された小さなエクトソームで放出され、HeLa 細胞では、エクソソームは CD63 やその他の後期エンドソーム分子を運ぶ小さな EV (sEV) の小さなサブセットであることを示しています。LAMP1/2 など。それらの分泌は、エンドソーム pH による中和の影響を特に受けやすいです。BSG と SLC3A2 は、HeLa 細胞でのエクトソーム分泌の特定のマーカーとして特定され、逆にエンドソーム pH 中和には鈍感でした。 興味深いことに、エクソソームや小型 EV のマーカーとして一般的に使用される別のテトラスパニンである CD81 は、CD63 ではなく CD9 のように動作します。ここで特定されたエクソソームとエクトソームの特定のマーカーと分子メカニズムは、それぞれの機能を解明するためのさらなる研究への道を開くでしょう。