タンパク質のリン酸化とグリコシル化を識別する方法

リン酸化を確認する主な方法は次のとおりです。インビトロリン酸化分析: 32P-ガンマ-ATP を使用したラジオメトリックキナーゼ反応を使用して、インビトロリン酸化状態を検出できます。この方法は半定量的ですが、リン酸化タンパク質の分子量を決定できます。 b.放射性パルス標識: in vivo でのリン酸化を検出するには、放射性パルス標識を使用できます。細胞は 32P-オルトリン酸の存在下で増殖し、その後特定のタンパク質が特異的抗体で免疫沈降されます。沈殿によって得られた放射性同位体は、SDS-PAGE 電気泳動によって分析され、X 線フィルム露光によって定量されます。この方法では、さまざまな生理学的条件下でのリン酸化を検出できます。 c.リン酸化特異的抗体: リン酸化特異的抗体には 2 つのカテゴリがあります。最初のカテゴリは、隣接するアミノ酸残基に関係なく、あらゆるリン酸化チロシン、リン酸化セリン、およびリン酸化スレオニン分子に結合するユニバーサルリン酸化チロシン/セリン/スレオニン抗体です。抗体の 2 番目のカテゴリーは、リン酸化特異的アミノ酸エピトープ抗体です。もちろん、上記の方法をデータ収集モードと組み合わせたり、質量分析後に（推定の）リン酸化部位を特定したり、リン酸化部位に対するユニバーサル抗体を使用して免疫沈降（IP）を通じて標的タンパク質が特定の種類の部位でリン酸化されているかどうかを判定したりすることもできます。 。

グリコシル化分析は、分析対象のタンパク質を酵素消化（トリプシン消化など）してから、液体クロマトグラフィー質量分析法（LC-MS）または親水性相互作用クロマトグラフィータンデム質量分析法（HILIC-MS/ MS) を使用して、特定のグリカン分子を持つすべてのタンパク質、またはターゲットタンパク質のグリカン結合部位を特定します。さらに、一部の糖ペプチドでは、無傷のタンパク質の質量分析 (MS) 分析により、タンパク質種の同定とそのグリコシル化状態に関するデータが得られますが、分解能は低くなります。

要約すると、タンパク質のリン酸化とグリコシル化を同定する方法は異なりますが、リン酸化/グリコシル化タンパク質、リン酸化/グリコシル化修飾部位、修飾レベルの同定など、どちらも質量分析を使用して分析できます。質量分析法は、その優れた分解能、精度、感度により、最も人気のある翻訳後修飾研究技術の 1 つでもあります。